真空冷冻干燥机对长双歧杆菌损伤作用的研究

摘要

长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）是人体肠道重要的益生菌，广泛应用于益生菌制剂、发酵食品、功能性配料领域。长双歧杆菌属于严格厌氧菌，细胞壁薄、对低温相变、渗透压、真空胁迫、冰晶机械损伤高度敏感。真空冷冻干燥是益生菌菌粉工业化制备的主流工艺，在获得低水分、高稳定性活菌制剂的同时，预冻、升华、解析全过程会从细胞膜、胞内大分子、胞内微环境多个层面对菌体造成不可逆损伤，直接降低冻干存活率与储存稳定性。本文结合冻干机理与菌株胁迫特性，梳理冻干过程中长双歧杆菌的损伤类型、损伤机制、关键影响因素，以及配套工艺、保护剂、设备控制方案，为长双歧杆菌冻干工艺开发、小试中试放大提供理论参考，同时阐述冻干设备温控、真空控制指标对菌体损伤的调控逻辑。上海舜制仪器制造有限公司依托科研型、中试型原位冻干设备，服务益生菌企业、高校微生物实验室开展菌株冻干工艺开发与损伤机理研究。

关键词：长双歧杆菌；真空冷冻干燥；益生菌；菌体损伤；冻干保护剂；存活率

1 引言

长双歧杆菌作为肠道原籍双歧杆菌，具有调节肠道菌群、改善肠道屏障、免疫调节等生理活性，活菌制剂要求产品货架期内维持足够活菌数。液态菌液储存周期短、运输条件苛刻，真空冷冻干燥（FD）依靠低温预冻将菌液体系固化，再在真空条件下使冰晶直接升华脱除，获得多孔菌粉，可大幅提升常温储存稳定性。

但冻干并非温和过程：菌体在水 - 冰相变、真空环境、水分脱除过程中承受多重胁迫。大量研究表明，长双歧杆菌冻干存活率通常低于乳杆菌等耐逆性更强的益生菌，工艺参数控制不当，存活率可降至 10% 以下。菌体损伤分为可修复亚致死损伤与不可逆致死损伤，亚致死损伤菌体在后续复苏、储存过程中极易失活，也是菌粉货架期活菌快速衰减的重要诱因。 目前行业内多聚焦保护剂筛选和存活率优化，而系统解析冻干各阶段对长双歧杆菌的损伤机制，是稳定放大益生菌冻干工艺的基础。

2 冻干各阶段长双歧杆菌的主要损伤类型与机制

冻干流程分为预冻阶段、一次升华干燥阶段、二次解析干燥阶段、复水复苏阶段，不同阶段胁迫因子不同，损伤靶点存在明显差异。

2.1 预冻阶段：冰晶机械损伤与渗透压损伤

预冻是菌体损伤的高发阶段，也是决定后续存活上限的关键环节。

1. 冰晶机械穿刺损伤 菌液降温过程中，胞外优先形成冰晶，随着冰晶不断长大，挤压、切割长双歧杆菌的细胞，造成细胞壁、细胞膜撕裂。长双歧杆菌为革兰氏阳性菌，虽有肽聚糖层，但细胞形态细长，对冰晶剪切力更敏感。慢速冻结时冰晶尺寸大，机械损伤显著；超快速速冻冰晶细小，机械损伤减轻，但会带来胞内冰风险。胞内冰一旦形成，会直接破坏胞内细胞器、核酸、蛋白结构，属于致死性损伤。
2. 溶质浓缩效应（渗透压胁迫） 水转化为冰晶，未冻结液相中的无机盐、代谢产物、保护剂浓度急剧升高，形成高渗环境。长双歧杆菌胞内水分外流，细胞脱水皱缩，细胞膜磷脂双分子层发生相变，膜通透性改变，胞内钾离子、ATP、胞内酶外泄，形成亚致死损伤。

菌株特性：长双歧杆菌对渗透压冲击耐受弱，相比植物乳杆菌，在高渗浓缩体系下更容易发生膜蛋白变性。

2.2 一次升华阶段：真空胁迫与界面损伤

预冻完成后腔体抽真空，冰晶升华，该阶段主要损伤来自真空与气 - 固界面效应：

1. 真空脱气与氧化损伤 长双歧杆菌是严格厌氧菌，真空环境下体系内溶解氧析出，微量氧气接触菌体，诱发胞内活性氧（ROS）爆发，氧化细胞膜不饱和脂肪酸、DNA、关键代谢酶。即使微量氧气，也会造成氧化损伤，这也是双歧杆菌冻干比兼性厌氧益生菌更难的核心原因。
2. 界面应力损伤 冰晶升华消失后，原本冰 - 水界面转变为气 - 固界面，细胞膜受到界面张力冲击，磷脂膜结构紊乱，膜流动性下降。该损伤多为亚致死损伤，菌体暂时保留活菌染色阳性，但代谢通路受损，复水后无法正常分裂增殖。
3. 局部过热崩解损伤 若搁板升温过快，菌体温度超过体系崩解温度，冻干基质塌陷，封闭孔隙，水汽无法逸出，局部残留液相，菌体二次遭遇水相胁迫，损伤叠加。

2.3 二次解析干燥阶段：结合水脱除导致生物大分子失活

解析阶段去除与蛋白、核酸结合的结合水。结合水是维持蛋白质三级结构、细胞膜磷脂有序结构的必需组分。 过度脱除结合水会造成：蛋白疏水基团暴露，酶蛋白变性；核糖体、核酸高级结构破坏；细胞膜从液晶态转变为凝胶态。这类损伤大多不可逆，直接导致菌体丧失复苏能力。 解析温度过高、干燥时间过长，会显著放大该损伤；但解析不足、残水偏高，菌粉储存过程中分子流动性高，损伤会在货架期持续累积，活菌快速下降。

2.4 复水阶段：损伤放大与复苏失败

很多菌体在冻干后为亚致死状态，本身并未死亡，但复水过程快速吸水，细胞膜结构已经受损，无法调节胞内渗透压，发生渗透性裂解，表现为平板计数存活率远低于荧光染色活菌数。 长双歧杆菌复水速率、复水介质渗透压、温度，都会决定亚损伤菌体能否修复。

3 影响长双歧杆菌冻干损伤的关键因素

3.1 保护剂体系（最常用的损伤调控手段）

保护剂通过玻璃化效应，在冻结干燥过程中形成无定形玻璃态基质，替代结合水支撑生物大分子，降低冰晶形成、渗透压冲击、界面损伤。

• 单一保护剂：海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇。海藻糖对双歧杆菌细胞膜保护效果突出，可稳定磷脂双分子层；
• 复合保护体系：糖类 + 抗氧剂（L - 半胱氨酸、维生素 C）+ 缓冲盐，适配长双歧杆菌严格厌氧、易氧化的特点；
• 禁忌：部分高浓度盐类会加重预冻阶段溶质浓缩损伤，不适合作为长双歧杆菌冻干保护基质。

3.2 冻结速率

• 慢速冻结：大冰晶，机械损伤重，胞内冰风险低；
• 快速冻结：冰晶细小，机械损伤轻，但降温速率过快容易诱发胞内冰，致死损伤上升； 长双歧杆菌存在最优冻结速率窗口，需要结合共晶点、玻璃化转变温度测试确定，不能一味追求急速冷冻。

3.3 冻干设备的温控与真空控制能力

设备性能直接决定胁迫强度，也是科研试验中容易被忽略的变量：

1. 搁板温度均匀性：搁板温差大，同一批次样品不同位置冻结、升华速率不一致，菌体损伤程度差异巨大，数据重复性差；硅油循环加热冻干机，搁板温差≤1℃，可保证平行样条件一致；
2. 真空稳定控制：真空度剧烈波动会造成升华速率忽快忽慢，界面应力反复变化，加重亚致死损伤；支持压力升终点判定的冻干机，可精准结束一次干燥，避免提前进入解析干燥；
3. 冷阱捕水能力：冷阱温度不足、捕水效率差，水汽返流，样品局部返潮，二次损伤菌体。

本研究试验设备推荐：科研原位冻干机，可搭载样品温度探头、真空稳压控制、共晶点 / 玻璃化转变温度测试模块，适合长双歧杆菌这类敏感厌氧菌的冻干损伤对照试验。

3.4 菌体自身生理状态

对数后期、稳定期早期的长双歧杆菌胞内相容性溶质积累更多，抗逆性更强；对数早期菌体细胞膜脆弱，冻干损伤显著更高，存活率偏低。菌液离心浓缩后的菌体浓度也会影响冰晶传导和保护效率。

4 损伤评价检测方法（试验方案常用）

研究长双歧杆菌冻干损伤，需要区分致死损伤、亚致死损伤，常用组合检测手段：

1. 平板菌落计数（CFU）：可复苏活菌数，反映最终有效活菌；
2. 荧光染色（SYTO/PI）：区分完整细胞膜（活菌）、破损细胞膜（死菌），识别亚致死菌体；
3. 胞内物质泄漏检测：测定胞外 ATP、核酸、钾离子浓度，评价细胞膜损伤程度；
4. 扫描电镜 SEM：观察菌体形态，判断冰晶挤压、细胞皱缩、裂解；
5. 氧化应激指标：ROS、MDA 含量，评价氧化损伤水平；
6. 透射电镜 TEM：观察胞内结构、核区、核糖体损伤；
7. 储存稳定性试验：跟踪 37℃加速储存下活菌衰减，评价亚损伤在储存过程的演变。

5 降低冻干对长双歧杆菌损伤的工艺策略总结

1. 菌株预处理：选用稳定期菌体，控制菌液浓度；厌氧条件下收集菌体，减少预试验阶段氧化；
2. 保护剂配方优化：优先海藻糖复合保护体系，搭配低剂量抗氧化剂，缓冲体系稳定 pH；
3. 预冻工艺：测定体系共晶点与玻璃化转变温度，搁板温度低于共晶点，选择合适冻结速率，充分保温，避免胞内冰；
4. 升华干燥：分段缓慢升温，严控样品温度不超过崩解温度，采用稳压真空控制，避免升华速率剧烈波动；
5. 解析干燥：控制最高温度，精准判定干燥终点，避免过度脱除结合水；
6. 出料与后处理：厌氧低湿环境出料、密封，隔绝氧气与水汽，防止储存阶段损伤持续累积；
7. 设备选型：采用温控均匀、真空稳定、可曲线编程、支持终点判定的原位冻干机，保障试验重复性，方便后续工艺放大。

6 研究意义与展望

长双歧杆菌冻干损伤是多重胁迫耦合的结果，单一保护剂或简单调整冻干时间，很难持续获得高存活率。区分亚致死损伤与致死损伤，解析不同阶段损伤通路，有助于解释很多试验现象：比如平板计数很低，但镜下菌体完整；冻干后活菌尚可，货架期快速衰减。 在产业化层面，基于损伤机理优化冻干曲线、保护剂配方、设备控制策略，能够显著提升长双歧杆菌菌粉的活菌收率与储存稳定性，为益生菌固体饮料、膳食补充剂、药用活菌制剂开发提供支撑。 上海舜制仪器的科研及中试冻干设备，支持微生物实验室开展长双歧杆菌、乳杆菌、双歧杆菌等敏感益生菌冻干损伤对照试验、保护剂筛选、工艺放大验证，配套完整曲线记录、数据导出，方便学术论文、项目研发的数据溯源。

7 结语

真空冷冻干燥不是无损伤干燥技术，对于长双歧杆菌这类严格厌氧、细胞结构脆弱的益生菌，冻干全过程存在冰晶机械损伤、渗透压损伤、氧化损伤、生物大分子变性损伤叠加。冻干工艺开发的本质，就是通过保护体系、冻结策略、设备热工参数调控，把损伤控制在可接受范围。对损伤机制的深入研究，是益生菌冻干工艺从 “试错摸索” 走向定向设计的基础。